基因型鉴定系列二：普通PCR
1198 人阅读发布时间：2025-01-14 10:11
在上篇推文中，我们了解到了如何查询JAX小鼠基因型鉴定方法。在实验室中，大家最常接触的可能是利用标准PCR，通过琼脂糖凝胶电泳的方式来判读基因型鉴定结果。下面我们来看看怎么样进行标准PCR吧。
在进行基因型鉴定的时候，我们首先要提取小鼠携带的DNA。在JAX通常使用快速DNA提取法：
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剪取鼠尾（2 mm），将其置于1.5 mL离心管或96孔板中
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添加75 μL 25 mM NaOH / 0.2 mM EDTA
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将离心管或孔板置于98℃环境中1小时，随后冷却至15℃直至进行下一步
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添加75 μL 40 mM Tris HCl （pH 5.5）
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4000 rpm离心3分钟，取2 μL上清液（直接使用，或以1：100比例稀释后使用）进行PCR扩增
这种方法相对简便快速，获得的DNA纯度足以进行大部分标准PCR。现在市面上也有很多供应商能够提供不同的DNA提取试剂盒，大家也可以根据自己的需要进行选择。但需要注意的是，在某些特殊情况下，对于快速提取的DNA还要进行纯化，才能够进行后续的PCR反应。
PCR反应所需的条件有：模板、底物（四种脱氧核糖核苷酸）、引物、Taq酶，为了确保反应的进行，还需有PCR仪、凝胶成像仪等必不可少的仪器设备。目前市面上大部分供应商可提供多种PCR Mix，其中包括已添加好的底物和Taq酶，因此只需按照试剂商提供的说明书，添加模板（即上一步提取的DNA）、引物和Mix就可以了。
在配置反应体系时，千万别忘记同时加上阳性对照、野生型对照、无模板对照等重要的对照小鼠基础知识五｜如何对小鼠进行基因型鉴定？最系统的整理来啦！，也别忘了加上IPC引物对。IPC全称为Internal Positive Control，其目的是为了验证反应体系是否能够成功工作。假设您想检测的是这些小鼠是否携带转基因，若仅仅使用了转基因引物对而没有使用IPC引物对，当没有出现转基因条带的时候，无法判断这是因为体系无法成功工作，还是这些小鼠确实不携带转基因。千万不要忽略它的重要性！
另外，在某些基因型鉴定方法页面，还可能出现这样的注释：
这是因为在较低的温度下（20-40℃），Taq酶仍具有一定的聚合活性，此时DNA聚合酶可能会延伸错配的目的基因和引物二聚体，从而产生干扰产物，甚至导致目标序列扩增失败。因此可以使用“热启动”以减少非特异条带：将PCR仪预热到94度再放入PCR体系，或者使用热启动Taq聚合酶进行反应，或加入Taq酶抗体进行反应。在JAX设施中，通常采用加入1:1的TaqStart抗体/Taq DNA聚合酶的方式。但在实际操作时可能不需要这么复杂——因为市面上已经有很多商品化热启动Taq酶，在选购的时候需要注意。
当配置好反应体系后，反应温度的选择又成了一个难题。为什么JAX提供的方法页面中，对于每一步反应的时间没有注明呢？
由于不同实验室使用的试剂不同，且PCR机器之间存在着必然的差异，有些方法在一个实验室能工作，在另外一个实验室则不一定。在JAX，可能在同一次PCR中用相同条件对于不同的品系进行基因型鉴定，因此需用到Touchdown以增加反应特异性。JAX使用的反应程序能保证每一种引物能完成扩增，但并非每一引物对各自的最佳扩增条件。为避免JAX提供的信息引起研究人员的混淆，认为对小鼠进行基因型鉴定只能使用JAX提供的方法，因此大约从2018年开始，JAX不再公布protocol细节。
市面上大部分PCR Mix试剂盒的说明书中，都有提供该试剂推荐的反应程序。因此，可以按照说明书，将这些反应条件作为第一步，随后根据得到的条带情况有针对性地进行优化。如果您的实验室先前有对其它品系进行过基因型鉴定，也可以尝试一下使用相同的条件。但可以肯定的是，不同引物对反应的最佳条件是不同的，这时候就需要根据具体情况进行分析及优化反应条件。
如果有需要，您也可以使用与JAX所用产品接近的商品化PCR 试剂盒：KK5519- 2G Fast hot Start 。
琼脂糖凝胶电泳是较常用的对标准PCR产物进行判读的方法。琼脂糖凝胶的浓度对于分离效果至关重要：琼脂糖凝胶浓度越高，分离效果越好。但浓度过高时，也会影响分子的迁移速度。通常而言，进行基因型鉴定获得的PCR扩增产物大小在1 kb以下。此时选择1.5%左右的琼脂糖凝胶即可满足需求—但也要根据获得的分离效果和实验经验进行调整。
在JAX提供的基因型鉴定方法页面，除引物序列外，也有提供条带大小和预期结果。以鉴定Apoe基因敲除小鼠（002052）的Protocol 22364 为例，页面标注如下：
由于这是一种通过靶向突变构建的小鼠，因此标注中的Mutant即代表纯合子。可以看到，如果小鼠是纯合子（Mutant），则获得琼脂糖凝胶电泳结果中只有约245 bp大小的条带；如果小鼠是野生型，则只有约155 bp大小的条带；如果小鼠是杂合子，则两种条带都有。页面中同时还提供了代表性的琼脂糖凝胶电泳图，可以作为参考。
