1、如何选取合适的免疫缺陷鼠作为实验模型？选择合适动物做实验主要考虑的问题？
 

免疫缺陷小鼠是免疫学、传染病、肿瘤学、造血和再生医学研究的宝贵工具。它们可以作为受体小鼠，接受小鼠肿瘤细胞、人类癌细胞系、患者来源的异种移植肿瘤以及人类免疫系统等的移植。然而，可用的免疫缺陷小鼠种类繁多，免疫缺陷程度不尽相同，并且这些模型有其各自适用的研究领域，增加了我们选择“最佳”模型的难度。
 

 

在选择合适的免疫缺陷小鼠模型时，需要综合考虑小鼠的遗传背景、免疫细胞组成、研究目的以及每个小鼠模型的局限性（泄漏、辐射敏感性、寿命、繁育情况）等，这里有一些提示可以帮助您Top Tips on Selecting the “Best” Immunodeficient Mouse Model for Your Research (jax.org)（请复制到浏览器打开：https://resources.jax.org/therapeutic-area-immunology/top-tips-on-selecting-the-best-immunodeficient-mouse-model-for-your-research），Choosing an immunodeficient mouse model (jax.org）（请复制到浏览器打开：https://www.jax.org/news-and-insights/2006/March/choosing-an-immunodeficient-mouse-model）。

 

2、人源化小鼠模型的制备技术?

免疫系统人源化小鼠根据移植物的类型可以分为PBMC人源化、HSC人源化和BLT人源化模型。BLT模型因为涉及到手术操作、供体组织来源、GvHD反应等问题，并不是很常用。目前在基础研究和临床前研究中最常用的还是PBMC/HSC模型，JAX的人源化模型也是特指这两种。有文献报道雌鼠的移植效率高于雄鼠^【1】，JAX的常规构建都是使用雌性小鼠。

对于PBMC人源化模型的构建，相对比较简单、成功率也比较高，有很多实验室会自行构建。通常是将人的PBMC计数后，通过尾静脉或腹腔注射到6-8周龄的免疫缺陷小鼠体内，一般移植一周内就能检测到比较高比例的人免疫细胞。移植前也可以对小鼠进行辐照，但会加快发生GvHD的发生。

而CD34人源化小鼠的构建，因为HSC（脐带血、骨髓、外周血动员或胎肝来源）需要迁移到骨髓腔中发育，所以在移植前需要先进行辐照清髓，如果是首次尝试构建的话，需要对辐照的剂量进行摸索。目前JAX是对3-4周龄的雌性小鼠进行尾静脉注射，也有文献是对出生后3日龄之内的小鼠心内注射，一般经过12周免疫重建后，可以检测到多种免疫细胞，并且重建完成后的小鼠生存期可达一年。

关于这两种人源化小鼠的构建，更详细的操作流程，可以参考文献：Creation of "humanized" mice to study human immunity - PubMed (nih.gov)^【2】


3、人源化小鼠的免疫特点，免疫细胞随生长发育的变化。

 

常见的PBMC、HSC人源化小鼠以及BLT人源化小鼠在移植后人免疫细胞的发育，以及随时间的变化情况，可以参考综述文章^【3】。

 

4、免疫系统人源化的小鼠，窗口期多久，哪些指标是重建成功的标准。重建成功后体重是否有变化。
 

人源化小鼠的窗口期，与人源化类型、受体小鼠品系有关。比如PBMC人源化NSG小鼠，由于较早发生GvHD，通常实验窗口期只有4-6周，而NSG-DKO小鼠由于敲除了小鼠内源的1/II MHC分子，延缓GvHD的发生，窗口期能达到4个月以上，不过这也与具体的donor、移植的细胞数有关。PBMC人源化小鼠在发生GvHD后会出现体重的降低，通常在体重降低达到15%时，需要将小鼠安死。

CD34人源化NSG或NSG-IL15小鼠在移植后可以存活1年以上，有报道发现NSG-SGM3小鼠在移植后可能发生巨噬细胞活化综合征MAS，导致小鼠贫血，窗口期会缩短，重建成功后应尽早实验。JAX的CD34人源化小鼠，是以外周血中人CD45+细胞大于25%为重建成功的标准，但是看以往的构建数据，通常都远大于这个比例。CD34人源化小鼠的体重会比相同周龄的非人源化小鼠要低一点，但是在HSC移植之后，小鼠的体重呈现持续增长。

5、人源化小鼠经常会发生GVHD，是否有哪些技术手段可以减缓GVHD的发生？
 

PBMC模型是将成熟的人外周血单核细胞（hPBMC）注入免疫缺陷小鼠体内而构建起来的，重建的免疫细胞以人源T细胞为主，由于MHC mismatch，成熟的人T细胞会对小鼠的细胞发生免疫反应，引起移植物抗宿主病（GVHD）的发生。有文献探究了GvHD发生的影响因素，发现与移植的细胞数目、移植前是否辐照以及供体有关^【4】，因此可以从这些角度优化构建过程，以减缓GVHD的发生。

另外，将鼠源I/II类MHC敲除，从根源上避免了人源T细胞的TCR与小鼠MHC的错配问题，可以有效降低GVHD反应、提高生存率、延长实验窗口期^【5】。

 

6、实验研究中免疫系统人源化小鼠的不足之处如何去规避？

尽管免疫系统人源化小鼠大大增加了我们对癌症生物学的了解、也有助于促进各种靶向免疫疗法的开发，但我们需要意识到的是，这些小鼠仍然不能完全模拟人体内的免疫细胞组成和功能，或者概括TME的各个方面。比如肿瘤与重建的免疫系统的HLA不匹配、缺乏HLA限制性T细胞免疫应答，B细胞的抗原特异性抗体反应缺陷，缺乏成熟的人中性粒细胞（在癌症中发挥重要作用）等等。但随着研究的深入，这些局限性也逐渐被打破，比如说HLA转基因小鼠可以促进HLA限制性 T cell 发育，人IL6的表达促进抗原特异性B细胞的应答，hCSF3转基因提高人中性粒细胞的发育成熟等等。

可能在现阶段，还是要重点关注需要研究的细胞类型，或者说是药物的作用机制。如果是靶点在T细胞、NK细胞的免疫调节药物，人源化小鼠的应用还算是比较成熟的，很多已上市的药物也在这些模型上得到过验证^【6】。对于这些研究而言，上述的不足可能不会对实验造成太大的影响。

 

7、不同CD34人源化小鼠的构建方法及重建细胞类型有何区别？

CD34人源化小鼠的构建，可以在HSC来源、是否辐照、受体鼠的周龄、品系等方面存在不同。HSC可以来源于人脐带血、骨髓、胎肝或者G-CSF动员的成人外周血，脐带血和胎肝是最常用的CD34+HSC来源，较成年人HSC的移植效率更高，后期CD3+T细胞比例更高，但总体来说，不同来源的HSC移植后，都能实现多个谱系的细胞分化，包括T细胞、B细胞、单核细胞、NK细胞等^【7】。

在辐照方面，因为HSC需要迁移到骨髓腔中发育，所以在移植前需要先进行辐照清髓。含有scid突变的小鼠（如NSG及其衍生品系）的辐射耐受度低，Rag敲除小鼠（如NRG,BRG等）可以耐受更高剂量的辐照。而携带了KitW-41J 突变的NSG或BRG小鼠，在不辐照的情况下，也能实现高免疫重建效率^【8-9】。

最常见的移植时小鼠周龄为3-4周龄，也有使用出生后3天内的小鼠或6-8周龄的小鼠。采用不同的NSG品系作为受体鼠，构建起的CD34人源化小鼠，在分化的细胞类型上存在差异，比如常见的二代品系中NSG-SGM3可以提高HSC移植后髓系细胞和Treg细胞的重建比例；NSG-IL15可以提高NK细胞的分化。


8、哪种人免疫重建小鼠适合PDX移植瘤模型研究

 

绝大部分PDX是可以在重度免疫缺陷NSG小鼠身上成瘤的，有几个特殊的情况，比如说前列腺癌，可能需要使用雄鼠作为受体；AML可能在NSG-SGM3小鼠上会更容易成瘤、成长的更快。在人源化小鼠上移植PDX，JAX的经验是90%的PDX是可以生长的，并且生长曲线与在NSG小鼠相似，但也有大约10%的PDX无法在人源化小鼠上生长。所以大家在实验之前，可以先通过查看文献，来确定这个PDX有没有过在人源化小鼠上生长的资料；如果是首次尝试，建议先进行少量的预实验。

另外，在人源化小鼠上进行PDX移植，还要考虑PDX的生长速度，和人源化小鼠的实验窗口期问题。如果在PBMC人源化小鼠上移植PDX，可以选择先移植PDX后进行免疫重建。



免疫缺陷小鼠在免疫、肿瘤、移植以及转化医学研究中使用非常广泛，许多免疫相关的研究中或多或少都有用过这些小鼠。免疫缺陷小鼠的选择、饲养、繁育以及实验操作等问题，经常对研究人员造成困扰。为了帮大家更好地了解免疫缺陷小鼠以应对相关问题，杰克森实验室技术信息科学家孙佳伟博士为大家准备了线上直播，在直播中孙博和大家分享了免疫缺陷小鼠相关的众多信息，也回答了线上观众提出的很多问题。

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JAX的人源化小鼠构建、购买相关问题
 

1.    人源化小鼠的移植成功率有多少？一般人源化程度达到多少可以被认定为人源化小鼠？
 

PBMC或CD34人源化小鼠的移植效率与受体鼠种类、年龄、性别、移植的细胞数目、操作、辐照强度、检测时间等多种因素有关，因此很难一概而论。JAX使用6周龄雌性NSG或NSG-DKO小鼠进行PBMC人源化的构建，移植前不进行辐照，移植2-3后即可发货，一般不进行重建效率的检测。由于PBMC人源化小鼠会较早发生GvHD，因此JAX暂时不向国内销售该模型。

JAX的标准CD34人源化小鼠的构建，分别是使用3周龄的雌性NSG (#005557)、NSG-IL15 (#030890)小鼠和4周龄的雌性NSG-SGM3 (#013062)小鼠，移植脐带血来源的CD34+HSC，经过8-12周的发育分化后，检测外周血中hCD45+细胞比例大于25%即认为重建成功。同时我们也会检测hCD19+, hCD3+, hCD33+细胞占hCD45+细胞的比例。

JAX也可以提供一些定制的人源化小鼠构建服务。比如有些研究必须使用雄性小鼠、或者需要特定类型的HLA供体，验证更多的免疫细胞marker等等，这些都是可以和JAX团队进行沟通的。

2.    CD34人源化小鼠的构建使用单一供体还是混合供体？由单一供体构建可提供的动物批量是多少？
JAX所有的人源化小鼠都是单一供体的，根据供体的不同，每一个donor的HSC可以构建出的人源化小鼠数量是有差异的，一般最少能构建50只，多的甚至能构建出150只。在订购前，可以备注需要1个供体还是多供体。通常对于药效研究来说，不同供体对药物的响应可能存在差异，因此建议在研究中使用多种 (3-5个) CD34+ 供体平均分布到各治疗组之间，降低应答的不稳定性风险；不应答的个体可以用来进行进一步的抗性机制的研究。

3.    NSG小鼠上打了PBMC，1周后检测CD45+比例，超过多少比例就是可以发货了?除了T细胞，还有其他细胞吗？
 

JAX的PBMC人源化小鼠在移植后2-3即可发货，一般不进行重建效率的检测。但由于PBMC人源化小鼠会较早发生GvHD，JAX暂时不向国内销售该模型。

不同donor构建的小鼠h CD45+细胞比例存在差异，但在移植后5、10天都有较高程度的T细胞重建，B细胞的重建比例较低，髓系细胞更低。NK细胞在d5天时较高，而d10急剧下降。

 

4.    JAX的小鼠能对公司出售吗？
 

JAX是一家非营利性的机构，小鼠模型绝大部分是来自于科研人员的捐赠，有些小鼠品系受捐赠方的License限制，只能提供给非营利性的机构，或者盈利性机构需要获取授权后才能购买，这个需要具体品系具体来看。

重度免疫缺陷NSG及其衍生品系NSG-SGM3、NSG-IL15等，以及由此构建的免疫系统人源化小鼠，绝大部分是可以对公司出售的。如果大家对特定模型感兴趣的话，可以联系技术支持来帮忙查询销售状态。